肿瘤微生物特征呈现抗肿瘤活性 | 微生物专题
论文标题：Intratumor microbiome features reveal antitumor potentials of intrahepatic cholangiocarcinoma
刊登日期：2022年12月
发表杂志：Gut Microbes
影响因子：9.434
技术手段：16S rDNA测序、scRNA-seq、代谢组、转录组
肝内胆管癌（ICC）是一种罕见的恶性肿瘤，在中国发病率高。微生物群已被证明寄生在人类的肝脏和胆管中，它们可以影响肝脏代谢、免疫环境和疾病状态；肠道菌群失衡与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化的进展有关，微生物群可以刺激肝脏炎症反应和肝纤维化，并诱导IL-6的产生，从而促进肝脏肿瘤的发展。目前，关于微生物与胆管癌间的研究相对较少，研究肝内微生物群对肝胆疾病的进展和治疗具有重大意义。
图1 研究思路
图2 ICC组织中微生物群组成的分析
作者收集了52例ICC患者的94个临床样本，其中42例配对样本（肿瘤组织：T组、癌旁组织：P组），其他包括未配对的3例肿瘤组织、7例癌旁组织和5例正常肝组织。通过16S rDNA测序（以下称16S测序）分析发现T组与P组间的微生物组成总体相似（图2a）；与正常肝组织相比，T组和P组的微生物组成具有显著差异。接着作者分析了T组、P组和正常组织样本中的微生物组成多样性，结果显示ICC癌组织中微生物的种类更多（图2b）,T组中菌群的α多样性显著高于P组（图2c）；T组、P组和正常组织样本的β多样性存在显著差异，但P组和T组相对于正常组织也有很大的相似性（图2 d）。该研究中的正常组织来源于肠癌或肝血管瘤肝转移患者，其与ICC癌组织及癌旁组织的病理背景差异较大，因此在后续的比较步骤中未纳入正常组织的菌群数据。
图3 实验证明组织中存在细菌
作者通过设计肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）等菌的DNA寡核苷酸探针，与ICC组织切片DNA分子杂交，HE染色和FISH荧光染色显示ICC组织中存在DNA（图3a）。接着，作者将新鲜ICC组织和癌旁组织匀浆涂布于平板上培养，结果观察到平板中存在菌落（鉴定存在头葡萄球菌（staphylococcus capitis），与16S测序结果相符），表明癌组织和癌旁组织中存在活菌（图3b）。通过TEM实验发现细胞内活菌存在于癌组织和癌旁组织中，并被溶酶体包裹（图3c）。溶酶体可以分解从外部进入细胞的物质，作者推测进入细胞的细菌会被溶酶体溶解，而未完全溶解的部分可以通过电镜成像观察到，这与观察的结果一致。
图4 scRNA-seq分析显示每种细胞类型中都存在细菌RNA
通过细菌培养和投射电镜实验验证了细胞内存在细菌，但是并没有整体描绘细菌在各种细胞类型中的分布变化，作者通过scRNA-seq分析了来自ICC患者的癌组织、癌旁组织和血浆样本，结果共获得11357个细胞可用于后续分析（图4a），tSNE聚类为11个细胞簇，细胞注释为成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞、粒细胞、中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、浆细胞和T细胞（图4b）。通过scRNA-seq分析样本中每个细胞中的细菌转录产物，结果表明细菌RNA不仅存在于胆管细胞等实质细胞中，但也存在于各种免疫细胞中（图4c）。血浆中细菌富集于白细胞的粒细胞中；在癌旁组织中细菌转录产物在T细胞中富集最为丰富，这可能是因为T淋巴细胞会积极参与癌旁组织的免疫反应(图4d)。肿瘤组织中最主要的细胞类型是恶性细胞，主要包括癌性肝细胞和胆管细胞，因此肿瘤中的大多数细菌都富集在该细胞类型中（图4e）。差异表达结果显示，肿瘤组织恶性细胞中细菌含量高于癌旁组织，而肿瘤组织T细胞中细菌含量低于癌旁组织。有研究表明细菌的蛋白肽片段结合肿瘤细胞后被T细胞识别，因此推测本研究鉴定的细菌可能直接参与人体的免疫反应。
图5 环境因素分析显示了细菌丰度与临床资料的相关性
作者通过探讨肿瘤微生物丰度与临床因素的关系，冗余分析（RDA）分析发现CA199对肿瘤组织细菌的影响最大，其次是白蛋白和白细胞（图5a）；其中CA199与白蛋白呈正相关，CA199与白细胞、高铁血红蛋白呈负相关。通过计算瘤内微生物分类与临床因素的相关性，发现炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）和偶氮假单胞菌（P. azotoformans）的数量与CA199呈正相关(图5b)。相比之下，结核性Burkholderia tuberum和P. fungorum的数量与CA199呈负相关，并与该细菌在ICC癌旁组织中的高表达相关，由此推测它们可能具有抗肿瘤特性。
基于16S测序结果，结合eggNOG和KEGG数据库对细菌的生物学功能进行预测，结果显示细菌菌群的功能主要参与氨基酸代谢（图6a）；KEGG功能预测表明菌落功能主要与氨基酸和核苷酸代谢途径相关（图6b）；作者进一步分析确认细菌菌群与氨基酸生物合成、嘌呤代谢、嘧啶代谢和丙酮酸代谢相关（图6c）。
图7 肿瘤和癌旁组织间细菌含量的差异分析
在门水平上，线性判别分析（LDA）结果显示癌旁组织中变形菌门（Proteobacteria）含量较高，而装甲菌门（Armatimonadetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和梭杆菌门（Fusobacteria）在癌组织中含量更高（图7a）。通过RT-qPCR进一步验证了肿瘤组织中的Verrucomicrobia和Proteobacteria的DNA水平与测序结果相符（图7b）。在属水平上，大多数丰富的细菌在肿瘤组织中表现出较高的水平，包括嗜酸菌属（Acidovorax）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和罗氏菌属（Roseburia）（图7c）。另外，P. fungorum和P. azotoformans在癌旁组织中含量高于肿瘤组织，作者推测癌旁组织中含量较高的细菌对肿瘤发展具有抑制作用，这与P. fungorum荧光半定量分析的结果相似(图7d-e)。
图8 体内外实验证明P. fungorum对肿瘤生长有抑制作用
作者利用人胆管癌细胞系研究P. fungorum代谢产物对癌细胞迁移的影响，用staphylococcus capitis（与金黄色葡萄球菌高度同源的菌）作为阳性对照进行体内外实验，结果显示菌液上清液（过滤无活菌）对细胞增殖有抑制作用，抑制效果随浓度增加而增强；transwell实验结果显示菌液上清液影响细胞增殖和迁移能力（图8a）；细胞划痕实验也证实菌液上清液可以抑制癌细胞迁移能力（图8b），表明细菌代谢产物中可能存在抑制癌细胞迁移的因子。
接着作者在6周龄裸鼠中构建了皮下移植肿瘤模型（图8c），除常规将肿瘤细胞皮下移植到小鼠体内作为对照组外，还设计了（肿瘤细胞+活菌）、（肿瘤细胞+细菌上清）、（抗生素处理+肿瘤细胞+活菌）3个实验组，体内实验结果显示实验组小鼠肿瘤体积相对于对照组减小（图8d），实验组活菌小鼠的肿瘤体积与对照组相比最低，细菌上清液组与抗生素处理组在接种至3周期间肿瘤体积变化无显著性差异，但活菌对移植瘤生长的抑制作用更明显。此外，通过FISH实验验证了P. fungorum在小鼠肿瘤中存在，验证了体内实验的准确性(图8e)。
图9 小鼠皮下移植肿瘤的代谢组学分析
为探究细菌对肿瘤的影响，作者通过非靶代谢组学发现实验小鼠和对照小鼠移植肿瘤中共有380个代谢物存在显著差异，其中187个代谢物表达下调，193个代谢物表达上调（图9a）。主成分分析结果显示两组之间存在不同的生物学特征（图9b）；其中P. fungorum代谢产物中显著上调的代谢物是2-丙基戊二酸(脂肪酸类，可能与药物代谢有关)和n -乙酰天冬氨酸(氨基酸、多肽及其类似物)（图9c）。对差异代谢物进行KEGG富集分析发现差异代谢物主要富集在丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢通路（图9d）；通过将功能预测结果与微生物组数据在通路上联合分析，发现该通路中n -乙酰- l-天冬氨酸的数量显著增加（图9e），作者推测由细菌作用导致代谢物改变。此外，通过用上清处理的细胞株进行转录组分析差异基因变化，KEGG代谢途径富集分析显示差异表达基因主要富集在碳代谢、糖酵解/糖异生、氨基酸生物合成、丙酮酸代谢、肿瘤代谢、碳代谢通路等；通过将转录组结果与代谢组结果进行比较，作者推测氨基酸合成代谢与细菌对肿瘤的作用密切相关。
该研究通过研究人员对99个组织进行16S测序以表征肿瘤内微生物群的特征，并且通过HE染色、FISH实验和TEM实验验证组织中存在微生物DNA；与癌旁组织相比ICC肿瘤组织中含有更多种类的菌群并且α多样性更高。同时，通过scRNA-seq显示瘤内细菌可存在于多种细胞类型中，主要富集在恶性肿瘤细胞中；此外，通过分析16S测序结果发现肿瘤组织中最丰富的细菌包括Burkholderiales、Pseudomonadales等；在癌旁组织中，P. fungorum含量显著高于癌旁组织，且与CA199 水平呈负相关；体外和体内实验结果表明，P. fungorum对肿瘤具有一定的抗肿瘤活性。代谢组学和转录组学表明，P. fungorum可通过丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢抑制肿瘤生长。
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